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Enquadramento

As infeções por parasitas pulmonares representam um grave problema de saúde para animais de companhia e espécies pecuárias, comprometendo a produção animal. O seu diagnóstico assenta no isolamento de larvas L1 presentes nas fezes, através da técnica de Baermann modificada (teste padrão-ouro) e sua posterior identificação microscópica com base nas características microscópicas.

Problema

Apesar desta técnica ser fácil de realizar e extremamente económica, a falta de equipamento, o desconhecimento do procedimento e a dificuldade na identificação das larvas, desencoraja a sua realização em ambiente clínico/ hospitalar, determinando o sub-diagnóstico destas parasitoses. O facto de não estarem disponíveis, comercialmente, outros métodos de diagnóstico, reforça a necessidade de criar um dispositivo de diagnóstico que simplifique a realização da técnica de Baermann in house.

Ideia

Assim, este projeto propõe desenvolver, testar, otimizar e validar um dispositivo de diagnóstico (EasyBaerman), que permitá o isolamento de larvas L1 de parasitas pulmonares das fezes de animais de companhia (cão e gato) e pequenos ruminantes para posterior observação microscópica. Embora assente nos mesmos princípios da técnica de Baerman, este dispositivo permitirá simplificar o procedimento, reduzindo o número de passos e tornando-o mais limpo e fácil de realizar em ambiente clínico/ hospitalar.

Financiamento

Amostras

Instituições de Ensino Superior

Equipa

O nosso protótipo inicial

O dispositivo EasyBaermann consiste num sistema composto por dois componentes de filtragem que se acoplam a um tubo de centrífuga de 50mL. O primeiro componente, a que chamamos “filtro das fezes”, destina-se a manter as fezes suspensas em água durante 12 horas, de forma a permitir a passagem das L1 das fezes para a água. Após esse período, o primeiro componente é substituído pelo segundo componente (filtro das larvas) que, por inversão do tubo, permite remover a água, isolando as larvas sob o filtro (nas amostras positivas). Posteriormente, o filtro é removido e observado ao microscópio para determinação do estatuto da amostra (positiva, se se observarem larvas ou negativa, se não se observarem larvas). 
O primeiro componente consiste, especificamente, numa base que permitiria fixar o “filtro das fezes” ao tubo e, simultaneamente, fechar o tubo com a tampa original, caso fosse conveniente O filtro do conceito original seria produzido com recurso a um sistema de dois moldes que permitiriam modificar a forma de uma malha de aço para uma forma de meia cápsula. No entanto, devido à baixa maleabilidade da malha não foi possível produzir o filtro de malha de aço, pelo que se testaram filtros de fibra de vidro e malha de nylon.

O segundo componente serve para fixar um segundo filtro ao tubo (este plano, “filtro das larvas”), usando elásticos e um o-ring. Pretende-se que este filtro, por inversão do tubo, permita a eliminação da água, retendo as larvas. Foram testados filtros de fibra de vidro com poros de 0,45µm e filtros de malha de nylon de 5µm.

Recolha de amostras biológicas

A testagem do protótipo EasyBaermann e a comparação com a técnica padrão (técnica de Baermann modificada) exigiu o acesso a amostras fecais positivas, frescas, na medida em que a recuperação das larvas exige que estas se encontrem viáveis (vivas e com mobilidade). 
Embora não existam dados disponíveis sobre a prevalência da infeção por parasitas pulmonares nas diferentes espécies animais, em Portugal, optou-se por iniciar a colheita de amostras fecais de pequenos ruminantes, porque, segundo a bibliografia, os ovinos e caprinos são mais suscetíveis à infeção do que os animais de companhia (cão e gato). 
Apesar de estar prevista a colheita de amostras de 100 animais, acabaram por ser colhidas amostras biológicas (sangue e fezes) de 411 pequenos ruminantes (203 caprinos, 208 ovinos). As amostras de sangue foram centrifugadas e o soro armazenado a -20°C para a realização de serologia (na eventualidade de se conseguir adquirir kit comercial para pesquisa da infeção). Uma pequena porção das amostras fecais (0,5 g) foi congelada para posterior extração de DNA e o remanescente foi utilizado imediatamente para pesquisa de L1 de parasitas pulmonares.

Numa primeira fase, as amostras foram apenas analisadas através da técnica de Baermann modificada, de forma a avaliar a prevalência da infeção em ambas as espécies.  

Não houve necessidade de colher amostras biológicas doutras espécies animais, onde à partida a prevalência seria muito inferior, porque o número de amostras positivas de pequenos ruminantes permitiria a testagem dos protótipos.

Testagem e otimização do protótipo

A testagem dos protótipos foi realizada utilizando fezes de caprino, na medida em que se determinou que a prevalência de infeção nesta espécie era elevada (95-96%). Foram analisadas simultaneamente, fezes frescas, através da técnica de Baermann modificada e dos vários designs melhorados do protótipo EasyBaerman os melhores resultados foram obtidos
com designs de base reduzida tendo-se obtido sensibilidades iguais às da técnica de Baermann modificada e contagens larvares apenas 7% inferiores. De notar que enquanto a técnica de Baermann utiliza 5g de fezes, o protótipo EasyBaermann
utiliza apenas 1g de fezes, pelo que os resultados obtidos são muito promissores.

Montagem e otimização da técnica de PCR

Foi extraído DNA dos sedimentos resultantes da técnica de Baermann modificada e EasyBaermann, bem como de parasitas adultos e larvas de espécies conhecidas (controlos positivos).

Foi montada, com sucesso, a técnica de PCR convencional para as espécies de parasitas identificadas nos pequenos ruminantes testados (Dictyocaulus fillaria e Muellerius capilaria). Não foi possível montar a técnica de PCR para as espécies de parasitas pulmonares que infetam animais de companhia (cão e gato), devido à ausência de material biológico.

Validação do dispositivo!

Para a validação do protótipo do dispositivo EasyBaermann propôs-se a comparação da técnica com a serologia e o PCR. Após uma análise de mercado, concluiu-se que não estavam comercialmente disponíveis kits de diagnóstico serológico para as espécies de parasitas pulmonares que infetam pequenos ruminantes. Relativamente à técnica de PCR, e após otimização da técnica, decorre a pesquisa de DNA de M. capillaris e D. filaria nas amostras dos sedimentos das técnicas de Baermann modificada e EasyBaerman e nas fezes. Não foi possível concluir os PCR, por falta de mão-de-obra e porque a entrega do equipamento (centrífuga) e dos reagentes necessários não foi realizada no prazo previsto. No entanto, nos próximos meses contaremos com uma estagiária que finalizará os trabalhos até final de dezembro 2023.

A realização da técnica de PCR nos sedimentos e fezes, permitirá determinar a sensibilidade do protótipo EasyBaermann e melhorar o diagnóstico destas parasitoses.

Consulte os nossos recursos!

Ebook

Poster

Risk Factors Associated to Protostrongylidae Infection in Small Ruminants from Centre Region of Portugal

32º World Buiatrics Congress 2024

Artigo científico

Pulmonary and Gastrointestinal Parasitic Infections in Small Ruminant Autochthonous Breeds from Centre Region of Portugal-A Cross Sectional Study

Animals Journal

Artigo Técnico

Parasitismo Pulmonar e Gastrointestinal em Caprinos da Região Centro

Revista Voz do Campo

Comunicação Oral

EASYBAERMANN: uma Alternativa ao Diagnóstico Tradicional

Congresso Internacional de Enfermagem Veterinária 2024

Poster

Parasitismo pulmonar e gastrointestinal em caprinos da região Centro

II Congresso Nacional Caprinicultura

Poster

ESTRONGILOSE PULMONAR EM PEQUENOS RUMINANTES: UMA DOENÇA SUBESTIMADA?

XXIII Congresso Zootecnia 2023

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Equipa

A nossa equipa multidisciplinar composta por alunos e professores de diferentes escolas.

Maria Pereira

Maria Pereira

Promotora

Professora ESAV

Ana Cristina Mega

Ana Cristina Mega

Professora ESAV

Andreia Garcês

Andreia Garcês

Professora ESAV

Carla Santos

Carla Santos

Professora ESAV

Carmen Nóbrega

Carmen Nóbrega

Professora ESAV

Carolina de Melo

Carolina de Melo

Aluna ESAV

Catarina Coelho

Catarina Coelho

Professora ESAV

Diogo Henriques

Diogo Henriques

Aluno ESAV

Fernando Esteves

Fernando Esteves

Professor ESAV

Filipe Neves

Filipe Neves

Aluno UALG

Joana Braguez

Joana Braguez

Professora ESTGV

João Ferreira

João Ferreira

Professor ESAV

Liliana Gomes

Liliana Gomes

Aluna ESAV

Mª João Viçosa

Mª João Viçosa

Professora UÉVORA

Marta Braguez

Marta Braguez

Professora ESAV

Rita Cruz

Rita Cruz

Professora ESAV

Teresa Letra Mateus

Teresa Letra Mateus

Professora ESAV

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